Brin complémentaire/ brin ADN à séquencer

[CamilleBaba]

Bonjour j’aurai une question concernant le cours sur le séquençage & plus précisement le séquençage SANGER ,

Dans le cours (pack ronéo été) , page 5 , dans « 7) Exemple de résultats »

1) On a un exemple de DDNTPs radiomarqués , avec les résultats des 4 tubes avec un patient sain et un patient muté. On nous explique où se trouve la mutation donc vis a vis de notre brin complémentaire c’est une Guanine qui devient Adénine , donc concernant notre brin a séquencer c’est une Cytosine qui est devenu une Thymine . Jusque l’a j’ai compris .

2) Ensuite on a un exemple avec un électrophorégramme :
Et la on nous indique simplement qu’au lieu d’avoir un pic Bleu = Cytosine , on a un pic en plus dans l’ADN muté qui est un pic Rouge = Thymine. Et par conséquent on a une mutation Cytosine qui devient Thymine.
Alors ça aussi je l’ai compris , seulement mon problème c’est qu’on ne précise pas que cette mutation concernant le brin COMPLÉMENTAIRE et qu’il faut indiquer la mutation du brin ADN À SÉQUENCER comme on l’a fait pour l’exemple 1) . On me dis juste qu’une cytosine est devenue une thymine . Du coup voici ma question :

Pour la méthode automatisée avec l’electropherégramme , les pics correspondent au brin complémentaire (comme c’est le cas pour l’exemple 1.) ou bien les pics correspondent directement au brin d’ADN à séquencer, raison pour laquelle on n’a pas préciser comme dans l’exemple 1, ce qui correspond au brin complémentaire et ce qui correspond au brin ADN a séquencer. (D’après que ce j’ai compris du cours les pics correspondent au brin complémentaire , mais du coup vis a vis de cet exemple je ne sais plus du tout) .

Voilà merci beaucoup!!!!!😊

[Stabilo'drey]

Coucou ! J'avoue que c'est un peu galère tout ça, on va reprendre !

On est dans le cas d'une substitution. Dans l'allèle normal on a un C et dans la mutation on a un T.

Pour l'ancienne méthode t'as bien compris : on lit le brin complémentaire. On lit sur la même ligne :
Un G qui par complémentarité donne un C qui est l'allèle normal
Un A qui par complémentarité donne un T qui est l'allèle muté
On a bien substitution d'un T au lieu d'un C. Jusqu'à là on est bon.

Pour la méthode automatisée on a une superposition de 2 pics :
Un pic bleu qui indique un C qui est l'allèle normal
Un pic rouge qui indique un T qui est l'allèle normal
Ici on a directement la séquence que l'on veut sans faire la complémentarité.

Mais lors de l'ajout des DDNTPs on créer forcément un brin complémentaire donc 2 possibilités :
Soit le brin que l'on a séquencé était le brin complémentaire de la séquence voulu et dans ce cas pendant le séquençage on retombe sur nos pattes et on obtient le brin souhaité.
Soit le brin à séquencer était la bonne séquence mais c'est la machine qui fait directement la complémentarité pour nous afficher directement la bonne séquence.

En soit quelque soit la théorie, ce qu'il faut que tu retienne au vu du cours c'est que :
Dans l'ancienne méthode il faut faire la complémentarité
Dans la méthode automatisée on lit directement la bonne séquence (de toute façon je pense pas qu'on te demandera de lire une séquence avec un séquençage automatisé)

Mais je vais essayer d'aller poser la question à la prof, pcq sur les schémas j'arrive pas bien à lire donc on moins on en aura le coeur net. Du coup je vais mettre ta question en attente, et je te donne une réponse plus tard (par contre ça risque d'être un peu long désolé, mais ça t'handicapera pas du tout pour les QCM).

Voilà j'espère quand même que j'ai pu t'aider et je reviens vers toi dès que j'ai pu discuter avec la prof !

[CamilleBaba]

Merci beaucoup!!!

Ce que je retiens donc c’est :

1) Ancienne méthode = brin complémentaire

2) Methode automatisé = brin à séquencer (mais on ne sait pas encore exactement pourquoi on a directement le brin à séquencer étant donner que durant le séquençage on a bien fait la synthèse du brin complémentaire. Par conséquent la question sera posée a la prof)

Merci beaucoup!!!!😊😊😊

[Stabilo'drey]

Coucou ! Les profs ont répondu aux questions du coup je te met la réponse lié à ton post :

Pour la méthode automatisé, on lit directement la séquence direct sur les résultats sans faire la complémentarité (comme on le fait avec l’ancienne méthode).
Est-ce que le séquençage est réalisé directement sur le brin complémentaire ? Ou est-ce que le séquençage est réalisé sur le brin direct mais c’est le séquenceur automatique qui fait la complémentarité pour nous sortir directement la séquence du brin direct ?
Lors de la réaction de séquence tout dépend du primer utilisé : si c’est avec le primer « sens » (vert sur le schéma ci-dessous) la lecture se fera directement, si c’est avec le primer « reverse » (orange sur le schéma ci-dessous)
c’est le brin reverse qui sera lut.

Le séquenceur ne tient pas compte du sens, il transforme juste les signaux de fluorescence en base. C’est à nous à tenir compte, en fonction du primer utilisé, du sens de lecture.
Ceci est vrai pour la technique automatisée et l’ancienne méthode puisque le principe est le même entre les 2, seules différences :
Technique automatisée : les 4 ddNTP sont mélangés ensemble, la réaction se fait dans un seul tube. La partie migration et lecture des bases sont automatisés.

Est ce que c'est bon ?

[Gio]

Salut!

Je m’incruste, on doit retenir donc que méthode automatisée=on lit directement mais uniquement lorsqu’on utilise un primer sens. Et cette utilisation est souvent implicite si elle n’est pas clairement dite dans l’énoncé si jamais (peu probable) ça tombe?

Merci!

[CamilleBaba]

Merci beaucoup !!
Ce que je retiens donc c’est que :
Que ce soit la méthode automatisée ou l’ancienne méthode ce qui va déterminer le brin qui est lu c’est le primers , c’est ça qui va nous dire si on se trouve si le brin a séquencer directement ou son brin complémentaire! Et donc :
Primer reverse = Brin complémentaire
Primer sens = Brin a séquencer

C’est bien ça ?

Merci beaucoup!!!!!! 😊😊😊

[Stabilo'drey]

Coucou !

Oui Camille tu as bien compris. Sauf que dans la méthode automatisée, dans son cours elle précise qu'on obtient un brin complémentaire. En fait je pense que les 2 cas sont possible, et que dans le cours elle prends l'exemple où on a la séquence complémentaire (c'est surement le cas qui doit être le plus courant).

Et Gio, oui tu as raison aussi, mais en soit dans le cours elle le précise pas vraiment, donc ça peut être l'un ou l'autre.

De toute façon maintenant que la question lui a été posé, elle ferai très attention dans ces énoncées si un QCM porte sur ces notions parce qu'elle sait qu'il y a eu une ambiguïté.

Donc pour récapituler, qu'elle que soit la méthode, on va avoir :

brin qui va être séquencer primers utilisé brin obtenu après séquençage

brin complémentaire primer sens LA SÉQUENCE DONNÉ EST LA BONNE
brin à séquencer primer reverse LA SÉQUENCE CORRESPOND AU BRIN COMPLÉMENTAIRE

Est ce que c'est plus clair ?

[CamilleBaba]

Alors là vraiment c’est NICKEL j’ai bien compris merci milles fois vraiment !!!!!