Réponses des professeurs (Maj 17/05)

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Première série

Question 1

Par rapport aux enzymes de restriction, un PACES a soulevé un doute de prononciation sur la notion de bouts francs et cohésifs :
Le professeur Paquis semble avoir évoqué que les coupures à bouts cohésifs étaient celles qui « se recollaient le plus facilement ».
Effectivement ce sont des enzymes qui génèrent des bouts cohésifs qui sont le plus utilisées pour le clonage car les extrémités simples brins sortantes facilitent l’orientation des inserts

Vous avez de votre côté dit plus tard dans la journée que « ce sont les extrémités franches qui auront plus tendance à se refermer (- sur lui-même) » Les extrémités franches se referment effectivement plus facilement au niveau du vecteur.

Je l’ai interprété dans le sens que des extrémités franches se fermeront davantage sur elles-mêmes qu’avec un insert, sans déphosphorylation. Considérez-vous cependant que l’une ou l’autre de ces coupures est "plus facile" ou "plus rapide" ?
En résumé les 2 sont justes, il n’y a pas de réelle différence tout dépendant dans quelle expérience on les utilise

Ou suffit-il de se concentrer sur le mécanisme du processus ?
OUI, le plus important est de comprendre les différentes techniques et quel outil sert à quoi et pourquoi ; la notion de coupure « plus facile » ou « plus rapide » n’a pas vraiment d’importance

Question 2 :

Il semble qu’il y ait une incompréhension, dans la partie sur le clonage moléculaire, sur la séparation des ADNc quand l’applique au cas du syndrome de Wolfram par exemple
Les étudiants ne perçoivent pas la raison pour laquelle les analystes doivent passer par un clonage moléculaire puis une amplification pour séparer des ADNc issus de la réverse transcriptase

Je vous joints des extraits des messages envoyés par les PACES :
« Pourquoi quand on a fait la reverse transcriptase pour obtenir l'ADNc à partir de notre ARNm muté, on ne passe pas directement au séquençage vu qu'on a isolé notre ARNm muté au moment de le transformer en ADNc ?
Du coup je ne vois pas en quoi le clonage moléculaire les sépare ?
« Mais pourquoi les ADN ne sont pas séparés directement après la reverse transcriptase ou au moment de la PCR avant même le séquençage et le clonage ? »
Une explication qui me vient après coup serait que les deux séquences (une mutée et une non mutée) seraient toujours mélangées dans la solution après passage de la réverse transcriptase, ce qui nécessite le passage par un clonage moléculaire, avec « une séquence / un vecteur ».
Cette séquence évoquée restant inconnue dans les cas jusqu’à l’étape de séquençage

Je viens donc vous consulter pour vérifier l’exactitude de cette possible explication


Votre explication est exacte :
Tout d’abord le prérequis qu’il faut garder en tête c’est que le clonage est nécessaire dans la mesure où le variant d’épissage est présent à l’état hétérozygote ; il y a donc un mélange d’ARN sauvage et d’ARN muté à des tailles différentes. Il est donc indispensable lorsque l’on doit séparer des molécules.

Pour la reverse transcriptase on utilise une extraction d’ARNm total. Si on utilise des oligodT pour générer les ADNc, TOUS les ARNm seront synthétisés en ADNc. Il faut donc réaliser une PCR pour amplifier la région d’intérêt en quantité suffisante pour pouvoir réaliser le clonage mais là encore à la fin de la PCR on a toujours un mélange Non muté / muté.
Dans mon exemple on a 2 fragments PCR à des tailles différentes. Si on séquence directement les produits PCR les séquences seront toujours mélangées donc illisibles.

On pourrait isoler les 2 produits PCR à partir du gel d’agarose (techniquement cela est réalisable) mais ça sous entend que la différence de taille soit suffisamment grande pour être résolutif sur gel et ce n’est pas toujours le cas.
Le séquençage direct sur des ADNc n’est pas possible, pas assez de matériel spécifique.

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Deuxième série

Question 1 :

Dans les éléments utilisables dans le cadre d’une extraction d’ADN, vous avez ajouté l’année dernière que le plasma était utilisable dans le cadre d’un DPNI. Cela reste-t-il toujours d’actualité cette année ?

Oui puisque pour le DPNI on extrait l ‘ADN fœtal circulant à partir du plasma de la mère


Question 2 :

Lors d’une électrophorèse, s’il y a contamination affichée par une bande dans la colonne de témoin négatif, vous nous avez répondu qu’il était impossible de réaliser une interprétation diagnostique des résultats obtenus.

Qu’il y ait contamination ou non, les résultats devraient de toute façon (pour pouvoir être comptés vrai dans un item), être confirmés par une autre technique, tel que le séquençage
Les étudiants demandent cependant s’il est possible, dans un QCM d’électrophorèse qui montre une contamination, de répondre à des items portant sur la taille des fragments obtenus par digestion

Une contamination dans le témoin négatif empêche d’utiliser la manip pour du diagnostic mais cela n’empêche pas des questions sur la taille des bandes observées dans les autres pistes par exemple. Effectivement pour le diagnostic il faut confirmer avec un 2ème tech. maintenant pour les QCM on peut demander à interpréter un gel avec ou sans 2ème tech.

La présence d’une contamination peut-elle influencer la taille des fragments d’ADN ?
Non la contamination ne peut pas influencer la taille des fragments d’ADN.


Question 3 : Cette question porte l’amplification par émulsion dans le séquençage haut débit :

Suite une à une mauvaise interprétation de notre part, les étudiants se sont posés beaucoup de questions sur la position précise des adaptateurs, très variable durant les étapes d’amplification
Ainsi, dans le cadre de la première étape d’amplification, pourriez-vous confirmer que l’adaptateur P1 s’accroche préalablement à l’extrémité 3’ du fragment d’ADN et l’adaptateur A à l’extrémité 5’ ?

Oui c’est ça mais ce qu’il faut SURTOUT retenir c’est que l’ajout des adaptateurs P1 et A permet d’amplifier, avec seulement 2 primers, l’ensemble des fragments d’ADN

Cela a également soulevé un autre point : si toutes les extrémités des fragments d’ADN sont rendues identiques grâce à la fixation de ces adaptateurs, les étudiants sont perplexes lorsque les schémas présents sur votre diaporama montrent les adaptateurs sur les extrémités des fragments d’ADN double brin placés de façon symétrique.
Or l’ADN en double brin est asymétrique, et cela ne respecterait pas la position énoncée des adaptateurs pour l’un et l’autre des brins
En cours, vous avez expliqué aux étudiants, je vous cite : « Grâce aux adaptateurs, on n’a plus besoin que d’un seul couple de primers pour l’amplification par PCR car tous les fragments auront les mêmes extrémités 5’ ou 3’. »
Ces fragments doivent-ils être bien considérés simple brin, pour concorder avec la notion ?

Le problème de faire des schémas c’est que l’on ne tient pas compte de la complémentarité des bases :
Etape de fixation des Adaptateurs [color=#00FF00]P1 et A :
Extrémité 5’ ------------------------------- Extrémité 3’
5’TGCA ------------------------------------ CCCGGG 3’
3’ACGT ------------------------------------ GGGCCC 5’
Tous les fragments d’ADN ont ainsi les mêmes extrémités (quelque soit la séquence intermédiaire sur mon schéma précédent). Pour l’ADN on parle d’extrémités 5’ et 3’ même pour l’ADN double brin. Quand je dis que tous les fragments d’ADN ont les mêmes extrémités je parle de l’ADN double brin

Alors cette réponse fait moyennement du sens, la notion énoncée au-dessus, vraie (et à retenir) pour un fragment double brin, devient perturbante si on dénature le double brin
Retenez déjà les points sur lesquels elle a insisté, et je demanderais un éclaircissement plus détaillé


Question 4 :

Concernant le séquençage des sphères : des étudiants s’étaient interrogés de la présence (sur les schémas de votre diaporama), de la présence de biotine sur un fragment d’ADN accroché à la sphère qui semble simple brin.
Ce que nous ne parvenions pas à reconstituer en suivant les étapes de la PCR
Il me semble que les tutrices de l’année dernière vous avaient posé une question similaire
(Suite à cela, elles avaient fait un long récapitulatif que vous pouvez retrouver ici : viewtopic.php?f=717&t=80604&p=441486#p441486)

Ainsi, pour cette année encore, les étudiants doivent-ils prendre en compte la présence d’un fragment d’ADN biotinylisé double brin lorsqu’il est accroché à la sphère, suivi d’une étape non détaillée de dénaturation / hybridation pour préparation au séquençage ?
Tout est dit dans la réponse des tutrices de l’an dernier (j’avais redétaillé avec elles les différentes étapes). Sur les sphères on a de l’ADN double brin et avant l’étape de séquençage les brins biotinylés ne sont pas retenus sur les sphères.

Une fois de plus, ce qui est important de comprendre ce sont les étapes dans les grandes lignes :
Fragmentation de l’ADN double brin
Ajouts des adaptateurs en 5’ et 3’ qui vont permettre d’amplifier tous les fragments d’ADN avec un seul couple de primer (utilisation d’un barrecode pour pouvoir mélanger plusieurs patients dans une même réaction de séquençage)
Isolement des molécules d’ADN sur support solide (ex. sphères)
Amplification par PCR des molécules isolées (amplification clonale)
Purification des sphères
Séquençage des molécules d’ADN fixées sur les sphères


Question 5 :

Dans le cadre de maladies génétiques, telles que l’Achondroplasie
Il avait été cité en cours une distinction entre les termes de maladie chromosomique et autosomique. Les étudiants ont du mal à percevoir la différence que vous avez précisé, autre que celle qu’ils connaissent déjà, entre autosomique et gonosomique

Les maladies chromosomiques vont affecter les chromosomes, anomalie de nombre ou de structure :
ex. trisomie 21, un chromosome 21 supplémentaire
Ex. remaniements chromosomiques : modifications de fragments de chromosomes …

Le terme de maladie autosomique s’adresse aux maladies qui touchent un autosome (donc un chromosome 1 à 22) ou un gonosome (X ou Y) mais au niveau du gène, il s’agit de modifications nucléotidiques. Les lois de mendel (hérédité autosomique dominant, récessif …) s’adressent à ce type de maladies.

Diverses :
- La notion de gène « de classe I » donnant des ARNr, et gène « de classe II » donnant des protéines est-elle toujours d’actualité pour le concours ?
Il s’agit d’une notion de biologie moléculaire de base donc tjs d’actualité

- Les primers utilisés pour le PCR et pour le séquençage peuvent-ils être identiques ? Oui

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Troisième série

Question 1 :

Dans le cadre d’une électrophorèse, si le témoin négatif n’est pas affiché à côté des puits d’analyse, doit-on comprendre qu’il a été réalisé auparavant ?
Non car de toute façon il doit être fait en même temps pour que l’analyse soit valide, l’analyse n’est pas interprétable dans ce cas.
Cela avait fait l’objet d’un QCM il y a quelques années, cette version est-elle toujours d’actualité ? Oui


Question 2 :

Si dans un item concernant la méthode de Sanger manuelle, les étudiants retrouvent la formule « Il est utilisé dans un tube chacun des 4 dNTPs ainsi qu’un ddNTP marqué », il s’agit bien d’un « d’un seul type de ddNTP marqué », ou de « plusieurs ddNTP de même type » ?
Oui, c’est un seul type de ddNTP sinon ce sera précisé plusieurs


Question 3 :

Est-il exact que : ADN recombinant = Vecteur + Insert ? (Pour confirmation) Oui
Les étudiants s’inquiètent d’une éventuelle mauvaise interprétation d’un énoncé, car il m’a été rapporté qu’il y avait parfois une confusion durant les cours, qui laisserait entendre que ADN recombinant = Vecteur. Oui, on sera précis dans l’énoncé


Question 4 :

Un P1 m’a transmis un QCM qui s’apparente à un QCM tombé à l’examen il y a quelques années, auquel nous aurions besoin de votre interprétation
Je vous fournis le QCM, l’interprétation du P1, et une question pour résumer
« Vous suspecter la présence de la mutation c.323 A → G du gène BST dans une famille. La séquence nucléotidique encadrant la mutation sur un allèle sain est la suivante : CCGATCG
On effectue alors une PCR – RFLP pour la rechercher.
Ci-dessous, les enzymes de restriction à votre disposition :
1) MGT : CCGAT
2) CRL : GGTTC
3) NTH : GTCG
Question : Parmi les enzymes suivantes, laquelle ou lesquelles seraient informatives pour détecter la présence de cette mutation ?
A) MGT et NTH
B) CRL uniquement
C) NTH uniquement
D) MET uniquement
E) Tout est faux »

Son interprétation est la suivante :
« Ma réponse serait C. Car pour moi MGT ne serait informative que de la présence / absence de l’allèle sain. Or même si elle ne coupe pas (= allèle muté), rien ne spécifie qu’on ait la présence de notre mutation et pas d’une autre »
Oui votre réponse est exacte

Je lui ai répondu que la mutation allait de toute façon être recherchée lors d’une étape de séquençage, mais cela ne répondait pas précisément à sa question

La question résumant serait donc :

Est-ce qu’une enzyme de restriction qui coupe l’allèle sain peut être informative de la présence d’une mutation précise (avant l’étape de séquençage), sachant qu’il peut y avoir la présence d’autres mutations ?
Non, ce qui est informatif c’est la détection de la mutation


Question 5 :

Peut-on extraire de l’ADN génomique à partir de plasma ?
Non pas vraiment, Dans le plasma c’est de l’AN fœtal circulant cad que l’on peut s’en servir pour du DPNI uniquement mais pas par exemple pour faire des PCR pour rechercher des mutations ou pour faire des PCR-RFLP.


Question 6 :

Est-ce qu’on peut considérer qu’éthanol à 95° = éthanol absolu ? OUI
Ou ces deux produits sont à différencier, respectivement l’un pour l’extraction d’ADN, l’autre pour l’extraction d’ARN ?
La différence pour l’extraction ADN et ARN c’est le pH du phénol : acide pour les ARN, basique pour l’ADN