Syndrôme de Wolfram
"Comment fait-on pour savoir que la mutation est entre l'exon 6 et l'exon 7 ? Cela fait référence aux diapositives 47-48 et 49 du poly."
Pour l'exemple que je vous ai donné sur le syndrome de Wolfram, on suspecte la présence d'une mutation en dehors des régions exoniques et des jonctions exon/intron du gène WFS1 car:
- on est dans une pathologie autosomique récessive (= 2 mutations
différentes hétérozygotes ou une mutation homozygote)
- dans mon exemple le séquençage a permis de mettre en évidence une mutation hétérozygote (c.1672C>T), il manque donc la 2ème mutation qui n'a pas été détectée par séquençage
La diapositive 47 résume ce que le séquençage a permis de détecter sur l'allèle paternel et maternel et en prenant un exemple de variant d'épissage pourquoi ce variant n'est pas détecté par la tech. de séquençage des exons et des jonctions exon/intron.
A cette diapo, on ne sait pas où est le variant d'épissage, je l'ai schématisé avec une étoile rouge pour bien comprendre pourquoi le séquençage ne le détecte pas.
La Diapo 48 (Variants d'épissage) représente ce qui se passe au niveau de l'ARN au moment de l'épissage pour que vous compreniez bien qu'un variant d'épissage ne peut se détecter qu'en travaillant sur l'ARN puisque la création du site cryptique d'épissage a une répercussion sur l'ARN: un partie de l'intron 6 devenant exonique.
La diapo 49 reprend les 2 précédentes.
A cette étape on ne peut donc pas savoir où se trouve le variant d'épissage chez nos patients (je l'ai schématisé pour faciliter
l'explication). On ne sait où se trouve le variant que grâce à la PCR faite sur l'ADNc, là encore sur la diapo 53 (Recherche des variants d'épissage) je n'ai représenté qu'une seule PCR qui encadre la région qui nous intéresse cad entre l'exon 6 et l'exon 7 mais il faut bien comprendre qu'en réalité il faut réaliser une combinaison de PCR différentes entre les différents
exons pour détecter la région où se trouve le variant. L'apparition d'une PCR à une taille inattendue permettra de cibler la région d'interêt.
ADN et gels
Peut-on dire que la séparation des molécules d'ADN se fait en fonction de leur taille et de la concentration du gel d'agarose OU d'ACRYLAMIDE grâce au courant électrique ? Doit-on considérer cet item vrai si le mot acrylamide est mentionné ?
Agarose et acrylamide sont 2 constituants possibles pour ce type de gels. Sur gel d'acrylamide, la résolution des ADNs de petite taille sera meilleure que sur gel d'agarose.
Achondroplasie
Concernant le QCM 6 du concours de l'année dernière, sachant qu'il n'y a pas de témoin négatif, peut-on confirmer le diagnostic d'achondroplasie ?
Oui car le témoin négatif est indispensable à l'étape précédente (dépot des produits PCR pour vérifier l'absence de contamination) mais pas à ce stade.
Reverse transcriptase
Concernant la reverse transcriptase, en cours vous avez dit que :
La reverse transcriptase incorpore les nucléotides un peu comme la polymérase sauf qu’à la différence de la polymérase, elle
fonctionne comme une matrice, elle n’utilise pas de primers
Dans le poly, il est marqué : Elle possède une activité 5’ 3’ ADN polymérase à partir d’une amorce ADN hybridée sur l’ARN.
Cela veut-il dire qu'il n'y a pas besoin d'amorce ADN spécifique pour la Reverse Transcriptase ?
Que doivent-ils retenir ?
La reverse transcriptase synthétise un brin d'ADN à partir d'une matrice ARN et d'une amorce ADN. Cette amorce peut etre n'importe quel fragment d'ADN simple brin hybridé sur un ARN simple brin.
La différence donc avec une ADN polymérase c'est le fait que la reverse transcriptase utilise l'ARN comme matrice et non l'ADN comme l'ADN polymérase.
"La règle d'or du travail intellectuel peut se traduire ainsi : ne tolère ni demi-travail, ni de demi-repos. Donne-toi tout entier ou détends-toi absolument. Qu'il n'y ait jamais en toi de mélange des genres." J. Guitton