PCR/ Clonage?

[RomainB]

Salut !
Il y a un petit truc que j'arrive pas à comprendre, pourquoi le clonage est nécessaire pour étudier des allèles séparément et à quel moment on les sépare lors de cette méthode.
Pour que ce soit avec le clonage ou avec la PCR on arrive au même résultat: un morceau d'ADN copié X fois. Donc si on sépare les 2 allèles avant de les mettre dans la PCR on pourra bien les étudier séparément non ?
Merci d'avance !

[Chob]

Salut !

A l'étape de la PCR tu ne peux pas séparer les 2 allèles d'un gène (ou du moins pas aujourd'hui), du coup c'est pour ça qu'on utilise le clonage moléculaire.

Tu vas couper par une enzyme de restriction la région d'un gène (qui contient la potentielle mutation dont tu veux prouver la présence par séquençage) sur les 2 chromosomes homologues : tu vas donc obtenir les 2 allèles du gène portant la région qui t'intéresse.
(Rappel : on veut les 2 car pour individu hétérozygote porteur d'une maladie, on veut connaitre la différence / les mutations qui différencient les 2 allèles)
Une fois que tu as isoler ces régions (ce sont tes inserts), tu vas les introduire dans des vecteurs -> tu auras des ADNrecombinants, chacun contenant un allèle , l'un ou l'autre , celui de la mère ou celui du père.

Ensuite, tu vas mélanger ces ADN recombinants, les 2 types ensembles, aux bactéries de sorte que chaque bactérie intègre un seul ADN recombinant
chaque bactérie aura donc soit l'ADN recombinant contenant l'allèle paternel , soit l'ADN recombinant contenant l'allèle maternel

Or tu sais qu'une bactérie (en milieu qui le permet) va se diviser / se multiplier +++ jusqu'à former un clone : un clone car cette bactérie va donner 2 cellules filles qui lui sont strictement identiques, ces 2 cellules filles vont faire de même etc. , donc au final tu auras un "tas" de bactéries toutes semblables les unes des autres. Du coup, comme la 1° bactérie contenait l'un des ADN recombinant, toutes les bactéries du même clone vont contenir aussi ce même ADN recombinant.
D'une part, on aura eu la multiplication des ADN recombinant
D'autre part, tu vas avoir sur ta boite de pétri des clones de bactéries, contenant l'ADNrecombinant avec l'allèle du père ou l'ADN recombinant avec l'allèle de la mère, qui vont être tous SEPARESles uns des autres : peut être que certains clones formés se chevaucheront si 2 bactéries de base étaient proche l'une de l'autre, mais globalement, après quelques jours de prolifération, tu vas avoir des clones isolés un peu partout sur ta boite de pétri, et en les prélevant un par un, sans les mélanger les uns aux autres, tu vas obtenir en grande quantité des ADN recombinant de "même type" (en les récupérant de l'intérieur des bactéries).

C'est comme ça que tu obtiens séparément les 2 allèles, puis après tu fais un séquençage pour chacun, puis tu compares, et tu trouves la / les mutations qui provoquent la maladie !

[Stabilo]

Bonjour,

C'est comme ça que tu obtiens séparément les 2 allèles, puis après tu fais un séquençage pour chacun, puis tu compares, et tu trouves la / les mutations qui provoquent la maladie !

Moi c'est justement ça que je n'ai pas compris : quand on fait le séquençage de ce qu'on a obtenu par PCR, dans le cas de l'achondroplasie, si on obtient un pic rouge et un pic bleu, on sait qu'il y a un allèle avec un G, et un allèle avec un A.
Et à l'issue du clonage, ok nos 2 allèles sont séparés, mais au final on obtient le même résultat, à savoir qu'un allèle est rouge donc A, et un allèle est bleu donc G.

Donc au final à quoi ça servait ?

Merci d'avance

[Chob]

Enfait dans l'achondroplasie c'est vrai que c'est pas uuuuultra génant parce que c'est une maladie qui est causée par une seule mutation / un seul nucléotide muté.

Mais desfois, tu vas avoir des maladies qui vont être dus à une ou plusieurs mutations qui ont beaucoup plus d'impact. Et dans ces cas là, tu n'auras pas qu'une seule superposition de pic de couleur différente, mais plein plein plein de superposition de pics, qui vont rendre ton séquençage illisible.

Si tu as le temps, va voir mon diapo que j'ai fait pour la Tut' rentrée :
diapo 25 : tu retrouves le séquences où tu as beaucoup de superposition de pics, noté N
diapo 26 : ça récapitule grosso modo ce que je viens de te dire plus haut

[Stabilo]

Okay merci beaucoup Chob !

[Dilou]

Hello!

A l'étape de la PCR tu ne peux pas séparer les 2 allèles d'un gène (ou du moins pas aujourd'hui), du coup c'est pour ça qu'on utilise le clonage moléculaire.

Je ne vois pas pourquoi cette étape n'est pas possible dans la PCR ?

merci

[Chob]

C'est juste que c'est pas le but de la PCR :

PCR -> amplification d'une région d'ADN double brin
Clonage moléculaire -> séparation de 2 populations d'allèles

Retenez ça et vous prenez pas le chou, c'est pas le moment

[Dilou]

D'accord merci