PCR : bornes d'amont / aval / élongation

[♦MC♦]

Salut, j'ai des p'tits soucis !


1) Comme on l'a précisé, l'élongation se fait dans le sens 5' - 3' (pour toutes les polymérases d'ailleurs, y compris notre chère Taq), l'erreur est aussi présente sur la diapo. Mais on dirait que l'erreur provient du fait qu'on ait suivi les flèches d'amorces (Primers) initiées en 3'. Alors :
- Dans le cours, il est dit qu'il est nécessaire de connaître uniquement les bornes d'amont et d'aval pour initier l'élongation.
Est-ce que les bornes d'amont = 5' ? Bornes d'aval = 3' ? Parce que dans la diapo, ce n'est pas très clair, je crois que c'est indépendant du 5'/3' et que c'est fait de manière aléatoire : genre
brin du haut 5' = amont / 3' = aval
Brin antisens du bas 3' = amont / 5' = aval

Donc si j'ai bien compris, pour permettre l'élongation, il est nécessaire pour chaque brin de réaliser 1 SEULE AMORCE (et pas 2 situées chacune aux extrémités), cette amorce doit être située dans la partie "proximale" du sens 5'->3' qui est soit la borne d'amont (alors située en 5') soit la borne d'aval (alors située en 5') ? C'est ça ?

Après, je n'ai pas très bien saisi une phrase non plus : "activité de relecture pour pouvoir incorporer un nucléotide, il faut qu'elle ait lu le nucléotide précédent"
1) Pourquoi parler de relecture et pas de lecture ?
2) Imaginons une séquence TATGCTTTAGTCT
On dit que Taq est située au niveau du T (3ème nucléotide) à l'instant t . Donc selon la phrase d'en haut, il faut qu'elle ait lu le nucléotide précédent ("A", à t-1, 2nd nucléotide), pour pouvoir incorporer le nucléotide complémentaire de A (à t-1) (donc T) ou de T (à l'instant t) (donc A) ?

Merci d'avance

[Chob]

Salut !

Il n'y a pas d'erreur sur la diapo.

Prenons la diapo 10 :
les primers sont hybridés coté 3' des brins parents, mais le brin qui va s'allonger à partir de l'amorce va bien commencer en 5' !

Regarde la diapo 29 tu comprendras mieux : tu vois bien que l'amorce est hybridé à l'extrémité / en 3' du brin parent mais va former l'extrémité 5' du brin fils en synthèse.

Et oui pour chaque brin parent tu hybrides une seule amorce à leur coté 3' pour que la synthèse de leur complémentaire se fasse de 5' en 3'
Si tu mets une amorce coté 5' du brin parent, ça veut dire que l'amorce formera l'extrémité 3' du néo-brin, tu ne pourras pas avoir la synthèse du complémentaire car la polymérase ne fonctionne pas de 3' en 5'.

Pour ta deuxième question, c'est juste qu'avant de continuer la synthèse du brin complémentaire, pour continuer l'élongation, à chaque fois l'ADNpolymérase doit vérifier que le nucléotide en t-1 est correct.

Je reprends la séquence TATGCTTTAGTCT dont la polymérase va synthétiser le complémentaire.
Le 3° T est le nucléotide auquel elle va apparier la base complémentaire à l'instant t.
Et bien pour pouvoir placer un A complémentaire de ce 3° T, elle va d'abord vérifier qu'elle ne s'est pas trompé à l'instant t-1 : elle va vérifier qu'en face du A (2° nucléotide), elle a bien ajouté un T.
Et c'est bien elle qui a mis le T en face du A à l'instant t-1, donc elle avait déjà "analyser" que le nucléotide sur le brin parent était un A, donc elle a mis un T en face. Et pourtant, pour continuer l'élongation du brin, et en l''occurence mettre la base complémentaire en face du 3°nucléotide T, elle doit vérifier qu'elle ne s'est pas gourrer au nucléotide d'avant : c'est pour ça qu'on parle de "relecture" et non pas de lecture.

[♦MC♦]

ah oui, hybridation au niveau 3' des brins parents correspondant au 5' des brins antisens en formation , ça c'est ok !

[Attend la suite avec impatience]

[Chob]

Répondu !

[♦MC♦]

super merci

[Fab117]

Bonjour !!

A propos de bornes d'amont et d'aval, il est dit que pour la méthode de Sanger comme pour la PCR il faudra connaitre la borne d'amont et la borne d'aval de la région a sequencer.
Mais pour la méthode de sanger, la borne d'amont seul nous suffit non ? car l'élongation va etre stoppé par un di-désoxyribonucleotide.
C'est une erreur de la ronéo ou j'ai pas bien compris