Interêt du clonage

[Ja_Ottavj]

Bonjour !
À propos de ce (superbe) post sur le clonage et son interêt : https://www.carabinsnicois.fr/phpbb/vie ... 7&t=161787

Je ne comprends toujours pas l'interêt :
Parce que ok le séquençage est illisible si on met les 2 allèles . Mais du coup si on peut séparer les 2 allèles pour les amplifier indépendamment en clonage moléculaire ; pourquoi ne peut-on pas amplifier chaque allèle en PCR pour ensuite les séquencer indépendamment aussi ? Parce que je me dis que la TAQ polymérase peut travailler sur un seul allèle non ?

Voilà j'espère que ma question est claire, ça fait longtemps que je comprends pas cette partie du cours, dans le sens où j'ai compris le soucis du chevauchement et tout ce qui est très bien expliqué dans le post cité.

Merci beaucoup en tout cas

[Stabilo'drey]

Coucou !

L'amplification dans le clonage moléculaire n'est pas l'intérêt majeur, le but est vraiment de séparer nos séquences. Mais en même temps on fait une amplification, c'est un bonus sympas quoi

Maintenant pourquoi ne peut-on pas amplifier chaque allèle en PCR pour ensuite les séquencer indépendamment aussi ?

Parce que quand on fait une PCR, on vient de prélever l'ADN du patient, on ne peut pas juste séparer nos allèles comme ça, on a aucune idée de quel brin appartient a quelle allèle. Dans une PCR il n'y a pas 1 seul brin a l'origine, il y en a plusieurs, d'où le fait qu'on ai nos 2 allèles de mélangés. La TAQ polymérase travaille sur 1 seul brin, mais il y a plusieurs TAQ polymérase dans 1 seul tube.
Je sais pas si c'est très clair mais retiens qu'on ne peut pas séparer nos allèles et faire des PCR différentes. Si on veut séparer nos brins on doit faire un clonage moléculaire+++.

(Fais attention ici je ne parle pas pour la NGS, parce que en NGS on ne réalise une PCR clonale donc pas de clonage moléculaire nécessaire)

Est ce que c'est plus clair pour toi ?

[Ja_Ottavj]

Bonsoir !
Déjà merci pour ta réponse rapide et détaillée !
Du coup mon interrogation se portera sur cette phrase

L'amplification dans le clonage moléculaire n'est pas l'intérêt majeur, le but est vraiment de séparer nos séquences.

Ce que je ne comprends pas c'est que lorsqu'on prépare notre ADN recombinant, on met un insert dedans. Mais, comme je l'ai compris si on fait ça, c'est parce que on ne peut pas séparer notre ADN prélevé, et c'est le problème de la PCR. Du coup, pour les insert, comment ferait-on tout d'un coup pour savoir de quel allèle il s'agit ?
Du coup le problème pour moi c'est qu'on revient au problème de départ :
→ comment déterminer quel ADN recombinant contient quoi ?

Bon, je sais que de toute manière tout ça n'est pas si important et que retenir la version par cœur même mal comprise est la meilleure option, mais vu que je bloque complétement sur l'interrogation que je viens de formuler j'ai peur de passer à côté de quelque chose (désolé si je t'embête mdrr)

[Stabilo'drey]

Au moment où l'on prépare nos ADN recombinant, on ne sait pas de quoi est composé l'insert à l'intérieur d'un vecteur en particulier. Le vecteur ne peut capter qu'un seul fragment et donc qu'un seul allèle. A cette étape, on ne sais pas encore quel est l'insert dans le plasmide. Il faut attendre de finir le clonage moléculaire, afin de voir les colonies, et puis séquencer séparément les colonies.

Jusqu'au moment du séquençage final, on ne sait pas quel est l'insert dans l'ADN recombinant. On sait juste que par colonie il y a forcément 1 seul allèle, mais avant de séquencer on ne sait pas lequel. On a tous nos brins d'ADN correspondant aux produits PCR (=insert), tous nos plasmide (=vecteur), et 1 insert va aller aléatoirement dans un plasmide, sans que nous on sache exactement lequel c'est. Ensuite les bactéries ne peuvent capter qu'un seul ADN recombinant, ce qui permet de bien séparer nos allèles.

Je sais pas si tu comprends mieux comme ça ?

[Ja_Ottavj]

Salut !
Je pense que j'ai enfin compris, merci beaucoup !!!
Bonne journée