dephosphorylation clonage

[sel06110]

Salut, j'ai pas bien compris le principe de déphosphorylation dans le clonage, je pourrais avoir une meilleure explication svp

[Stabilo'drey]

Coucou je vais essayer de t'expliquer ça avec des schémas.

Déjà il faut que tu te rappelle que pour créer une liaison phosphodiester on a besoin d'avoir une extrémité 5' phosphate (P) d'un nucléotide qui se lie à l'extrémité 3' OH d'un autre nucléotide.

Quand on va avoir notre insert et qu'on va vouloir le mettre dans notre vecteur, en fait on veut juste relier une séquence de nucléotide à une autre et donc in fine créer une liaison phosphodiester.

Dans le cas d'extrémité à bout cohésives, c'est plutôt facile de créer la liaison parce qu'avant cela les 2 brins se sont appariés car leur bout de séquences sont complémentaire. Une ligase va ensuite créer la liaison mais les séquences sont déjà "emboités".

Pour les extrémités à bout franches (ce qui nous intéresse), c'est un peu plus relou.
Les extrémités sont net, on à pas de morceau de l'insert qui va pouvoir s'insérer par complémentarité. Donc l'insert doit venir s'accoler aux extrémités du vecteur pour que la ligase puisse faire la connexion. Et le seul moyen que les 2 morceau s'accolent, c'est grâce à leur extrémités P et OH.

Il faut que tu te les imagine comme des aimants : un P libre, va chercher comme un aimant son un OH libre afin de créer une liaison (et inversement).

Donc a partir de la on va prendre les schémas : l'extrémité P est en vert et l'extrémité OH en violet

Donc on va toujours avoir ce fonctionnement d'aimant : un bout vert doit aller avec un bout violet.
Sauf que y'a 2 possibilités :

Quand ça se passe bien : l'insert s'intercale entre le vecteurs, les morceaux sont accolé et la ligase peut faire son boulot.

Mais on a aussi un cas où ça se passe pas bien : les extrémités du vecteurs s'accolent parfaitement, c'est logique puisse qu'une liaison existais et qu'on vient de la couper pour mettre notre insert. Il est donc possible que les morceaux se recollent entre eux avant que l'insert ne puisse venir. On retour au point de départ et on se retrouve avec un vecteur sans insert.

Du coup pour palier à ce problème on va changer toutes les extrémités du vecteur. On va mettre uniquement des extrémités OH pour être sure que les 2 morceaux ne se recollent pas ensemble.

Mais l'insert lui a toujours les bonnes extrémités :

Il va y avoir un côté où on a bien le OH qui s'accole avec le P donc tout est bon, on a bien cet effet d'aimant qui opère

De l'autre côté on a 2 extrémités OH qui s'accolent, mais c'est pas grave parce que comme on a pu créer la liaison de l'autre côté, les brins ont déjà commencer à s'intégrer au vecteur. Alors on va avoir un système de réparation qui va venir changer les extrémités OH du vecteur en P et pouvoir finir la ligation.

En mettant des extrémités OH à toutes les extrémités du vecteur, on est sur que le vecteur ne se replie pas sur lui-même et on est donc sur qu'il a intégré l'insert !

Et voilaaaaa ! J'avoue cette notion est hyper galère à comprendre. On est vraiment sur du détail.
Si tu encore du mal, n'hésite pas à reposer des questions !
Sur ce bon courage à toi !!

[sel06110]

MERCIII ça m'a bien aidé a comprendre avec les détails et les schémas, bonne journée