PCR RFLP vs PCR+séquençage

[N06]

Coucou alors voilà, je ne comprend pas à quel moment utiliser la PCR RFLP et la PCR+ séquençage. en soit elles sont toutes les deux utilisées pour la recherche de mutation ciblée et déjà connue donc je vois pas comment on peut choisir entre les deux et aussi pour le cas du syndrome de Wolframe je comprend pas pourquoi on fait un clonage moléculaire puis un séquençage ( dans le cas d'un problème sur l'exon) puisque on sait déjà a quel endroit se trouve le pb grâce à l'étude des ARNm ( en faisant les PCR aux jonctions puis une électrophorèse).

[N06]

je voulais dire sur l'intron pas exon dsl

[Stabilo'drey]

Coucou !

Déjà je te remet ce magnifique schémas bcp trop important (désolé il est un peu flou et fait pas gaffe à ce qui est entouré en rouge)

Alors non dans la PCR + séquençage on est pas dans le cas d'une mutation ciblée.

Une mutation ciblée c'est quand on connait le gène et l'endroit exact dans le gène. Dans l'achondroplasie on sait précisément où se situe la mutation. Donc on peut utiliser une PCR RFLP.

Dans un syndrome de Wolfram on connait uniquement le gène mais pas l'emplacement exact dans le gène, car la mutation peut se trouver à plusieurs endroit dans le gène et quand même donner la maladie. Donc on est pas sur une mutation ciblé, et donc faire une PCR RFLP n'est pas possible. On va être obligé de séquencer le gène, et pour séquencer on est obligé de réaliser une PCR avant.

Pour ce qui est du clonage moléculaire, alors oui, une fois la PCR et le séquençage réalisé après l'intervention de la transcriptase inverse et création de l'ADNc, on connait effectivement l'endroit de la mutation. Donc on peut diagnostiquer la maladie. Mais il est nécessaire de lire correctement la séquence pour comprendre ce qui c'est passé et analyse le nouvel ARNm lorsqu'il y a la mutation. Et ici ce n'est pas possible car la séquence est illisible. Je te met ici un post qui explique le principe du clonage moléculaire : https://www.carabinsnicois.fr/phpbb/vie ... 7&t=161787

Est ce que c'est plus clair pour toi ?

[N06]

c'est super merciiii

[N06]

je viens d'agrandir l'image donc en résumer dans la "colonne" pour la recherche sur un gène donné on peut utiliser la PCR séquencage une fois seulement qu'on a fait la PCR RFLP et donc qu'on sait à peu près dans quelle partie se trouve la défaillance mais on ne peut pas la faire directement sans être passé par RFLP ?

[Stabilo'drey]

Alors non pas exactement. En fait il faut que tu comprennes les méthodes.

La PCR RFLP c'est lorsqu'il y a une digestion enzymatique. Ça veut dire qu'on utilise des enzymes de restrictions. Et une enzyme de restriction ça coupe précisément à un endroit dont elle reconnait la séquence. Donc pour utiliser des enzymes de restriction, il faut précisément connaitre l'endroit de la séquence où l'enzyme va pourvoir couper, c'est pour ça qu'on utilise cette technique UNIQUEMENT quand la mutation est ciblé, et c'est impossible d'utiliser cette technique si la mutation peut survenir partout dans un gène.
Mais une fois qu'on a réalisé une PCR RFLP, il est nécessaire de lire la séquence et de faire un séquençage pour confirmer le diagnostic.

En fait on peut faire une PCR + séquençage sur une mutation ciblée mais on utilisera préférentiellement d'abord la PCR RFLP.
Par contre sur une mutation d'un gène donné il est impossible de faire une PCR RFLP. On est obligé de faire une PCR + séquençage (ou une NGS)

Est ce que c'est plus clair comme ça ?

[N06]

ah ouii j'ai compris merciiiii t'es géniale