Annales 2015 ex7

[MP3007]

Bonjour, Je comprends tous les calculs mais je ne comprends pas comment on fait pour savoir quel site de reconnaissance a l'insert....
Merciiii

[Nom_de_Zeus!]

Hey !

Piste 1 : après digestion par SacI et BamHI, on obtient :
• Un petit fragment de 1800 – 900 = 900 pb
• Un grand fragment (avec insert) de 2100 + 100 = 2200 pb

Piste 2 : après digestion par SmaI, on obtient :
• Un fragment unique de 3100 pb (l’enzyme a juste ouvert le plasmide avec insert)
Les pistes 1 et 2 nous ont permis de vérifier que l’insert a bien été intégré dans le plasmide (c'est leur seul intérêt)

Piste 3 : après digestion par EcoRI, on devrait normalement obtenir :
• Un petit fragment de (800 – 600) + 100 = 300 pb
• Un grand fragment de 3000 – 200 = 2800 pb

En analysant le gel, on voit qu’on obtient bien le fragment de 2800 pb mais on remarque aussi que le fragment de 300 pb a été coupé en deux fragments plus petits de 120 pb et 180 pb !

Hypothèse : l’insert possèderait aussi un site de reconnaissance pour EcoRI, et d’après la taille des fragments obtenus, ce site de coupure pourrait se situer à deux endroits différents sur l’insert (soit l'un soit l'autre, mais pas les deux) :

1. Le site de reconnaissance pour EcoRI pourrait se situer en position 20 de l’insert
OU
2. Le site de reconnaissance pour EcoRI pourrait se situer en position 80 de l’insert

Piste 4 : après digestion par SacI et EcoRI, on obtient par rapport à la piste 3 :
• Un fragment théorique de (800 – 600) + 100 = 300 pb qui a encore été mystérieusement coupé en deux fragments plus petits de 120 pb et 180 pb
• Un fragment de 2700 pb
• Un fragment de 900 – 800 = 100 pb

Le but c'est de savoir où a pu couper EcoRI pour générer ces deux bouts mystérieux de 120 et 180 pb qu'on ne s'attend pas à obtenir (on est sûrs que c'est EcoRI qui a fait ça puisqu'on obtient ces résultats quand on utilise uniquement EcoRI et le fait d'utiliser SacI en plus ne modifie pas le redécoupage du fragment de 300 pb, on génère un fragment de 100 pb prélevé du fragment de 2800 pb qui en fait désormais 2700, ce qui n'a aucun rapport avec notre problème c'est juste pour essayer d'embrouiller)

On a donc un fragment de 300 pb qui devient deux fragments de 180 et 120 pb

Ce fragment va de la position 600 à la position 800, et on sait que l'insert est intégré au niveau de la position 700, on a donc l'insert de 100 pb en plein au milieu de ce fragment de 300 pb avec 100 pb du plasmide avant, et 100 pb du plasmide après

On a deux façons de générer un fragment de 120 pb et un fragment de 180 pb :
1. soit on a d'abord le fragment de 180 pb puis le fragment de 120 pb
2. soit on a d'abord le fragment de 120 pb puis le fragment de 180 pb

En effet l'électrophorèse permet de lister les fragments obtenus mais pas d'obtenir leur agencement les uns par rapport aux autres et donc de savoir où sont les sites de coupures qu'on ne connaît pas

Comme les 100 premières paires de bases du fragment de 300 pb ne correspondent pas à l'insert, si on a d'abord le fragment de 180 pb le site de coupure EcoRI sera en position 80 de l'insert : on fait 180 - 100 pb avant l'insert qu'on ne prend pas en compte = 80

De la même manière, si on a d'abord le fragment de 120 pb le site de coupure EcoRI sera en position 20 de l'insert : on fait 120 - 100 pb avant l'insert qu'on ne prend pas en compte = 20

Les deux versions sont aussi probables l'une que l'autre, on n'a aucun moyen de savoir laquelle est la bonne, on ne peut donc affirmer aucune des deux versions et seulement supposer sans avoir plus d'informations

A) Vrai
B) Faux : voir piste 4
C) Faux : l’insert en possède un pour EcoRI (soit en position 20, soit en position 80)
D) Faux : on ne peut pas l’affirmer car EcoRI pourrait aussi très bien couper en position 80 de l’insert, attention à la formulation de l’énoncé ! L’item aurait été vrai s’il y avait « peut posséder » à la place de « possède »
E) Faux