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[Résolu] Les etapes du sequençage

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[Résolu] Les etapes du sequençage

Messagepar jonathan.d » 16 Jan 2018, 18:27

Salut :) j'aimerais savoir si c'était possible d'avoir un petit recap sur les étapes du sequençage sanger parce que je comprends pas trop comment se realise les etapes d'élongation et de migration electrophorétique. Mercii :)
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jonathan.d
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Re: Les etapes du sequençage

Messagepar Nom_de_Zeus! » 16 Jan 2018, 20:36

Hey ! :D

Le principe du séquençage est de déterminer la succession de nucléotides, c'est-à-dire la séquence qui compose le fragment d'ADN qui nous intéresse :)

La méthode de Sanger est aussi appelée la méthode enzymatique des di-désoxyribonucléotides (ddNTPs), et ce que tu dois à tout prix retenir c'est qu'il s'agit de LA méthode de référence du séquençage !
Même si maintenant on a d'autres moyens plus sophistiqués pour faire du séquençage comme le Next Generation Sequencing (NGS) on n'a pas assez de recul avec ces méthodes, du coup on devra toujours confirmer le diagnostic avec un Sanger ! :glasses-nerdy:

Du coup comment ça marche le Sanger ? :question:

Tu as un fragment d'ADN inconnu que tu veux séquencer (c'est tout le concept :mrgreen:)
Il te faut UNE SEULE amorce = primer (alors qu'il en faut deux dans la PCR pour encadrer la région à amplifier attention), ce qui va permettre à l'ADN polymérase de synthétiser un brin complémentaire de la séquence d'ADN qui t'intéresse dans le sens 5'-3' (on oublie pas la Biomol <3)

On va avoir une succession de 30 à 35 cycles (les mêmes que la PCR) qui vont se répéter ! Chaque cycle contient trois étapes :
- Dénaturation à 95 degrés: on casse /dénature les liaisons hydrogène qui unissent les deux brins complémentaires avec de la chaleur pour obtenir deux fragments d'ADN simple brin

- Hybridation à 50 degrés: appariement du primer/de l'amorce qui s'apparie par complémentarité au brin simple d'ADN

- Élongation à 60 degrés: l'ADN polymérase attache un à un les nucléotides complémentaires du brin simple qu'on veut séquencer (qui sert de matrice pour le coup)

Tu dois connaître les ordres de grandeur des températures de chaque étape c'est super important !!! :soldier:

Lors de l'élongation, la polymérase ajoute AU HASARD :
-Soit un dNTP, qui a été désoxygéné une fois sur son carbone 2'
-Soit un ddNTP, qui a été désoxygéné deux fois, sur son carbone 2' et sur son carbone 3' de sorte qu'on ait une extrémité 3'-H et non plus une extrémité 3'-OH ! :desire:

Du coup, à chaque fois que la polymérase ajoute un ddNTP la synthèse s'arrête car on ne pourra plus générer de liaison de type phosphoester avec le nucléotide d'après ! (on aura bien l'extrémité 5'-P du prochain nucléotide mais plus l'extrémité 3'-OH du dernier nucléotide de la séquence à avoir été incorporé) :crying:

L'incorporation d'un ddNTP par la polymérase stoppe donc la synthèse du brin !

Comme on va répéter un cycle = Dénaturation + Hybridation + Élongation pendant x fois on obtient au final un mélange de beaucoup de fragments d'ADN générés de toutes les tailles possibles puisque la polymérase ajoute à chaque fois au hasard un dNTP ou un ddNTP ! (on aura donc selon toute probabilité un fragment qui s'arrête au nucléotide 1, un autre au nucléotide 2, puis un autre au nucléotide 3 etc... Et on aura aussi du coup mécaniquement un bout qui correspondra à la séquence complète !)

Maintenant, le problème est de pouvoir lire cette séquence, on ne peut pas repérer les dNTPs, par contre nos ddNTPs on étés radiomarqués (on les as rendu fluos si tu veux, chaque couleur correspond toujours à la même base, par exemple toutes les thymines en rouge, les adénines en vert, les guanines en noir et les cytosines en bleu, du coup quand on voit une couleur de fluorescence en fin de chaîne on sait à quel nucléotide ça correspond !)

Ce qu'on va faire en sachant ça, c'est une migration électrophorétique pour classer nos fragments en fonction de leur taille !
On les met sur un gel d'acrylamide dénaturant tout en haut du gel auquel on applique un champ électrique. Ce champ va induire la migration des fragments sur le gel qui se comporte comme un filet de pêche, plus on va loin (c'est-à-dire vers le bas) et plus les mailles du filet se resserrent et sont étroites :
-Les plus petits fragments qui sont aussi les plus légers migrent le plus loin, c'est-à-dire le plus en bas puisqu'ils peuvent plus facilement se faufiler entre les mailles du gel
-Les plus gros fragments qui sont aussi les plus lourds migrent le moins loin parce que les mailles du filet les retiennent

Les plus petits fragments qui migrent le plus loin contiennent le moins de nucléotides, il ont donc incorporé un ddNTP plus tôt, dans les premiers nucléotides de la séquence puisque la suite de la synthèse s'est arrêtée !

Inversement les fragments migrant le moins loin on incorporé un ddNTP beaucoup plus tard.
Le brin le plus haut situé qui a migré le moins loin correspond donc à la séquence complète, mais à chaque fois on ne connaît que le dernier nucléotide de la séquence, c'est-à-dire le ddNTP car c'est le seul à être marqué !
On a donc besoin de tous les fragments pour lire la séquence complète car on ne peut lire que le dernier fragment de chaque brin!
Comme mécaniquement la synthèse se sera arrêtée à chaque fois à une position nucléotidique différente, on pourra lire la séquence complète en regardant quel est le dernier nucléotide incorporé.
On obtient la séquence en lisant le dernier nucléotide de chaque brin en commençant du bas de l'électrophorèse (où les ddNTPs correspondent aux premiers nucléotides de la séquence) et en remontant (où les brins sont plus lourds car les ddNTPs correspondent aux derniers nucléotides de la séquence et on stoppé la polymérase beaucoup plus tard) !

Voilà pour la méthode Sanger qui fait office de référence, est-ce que c'est clair ? :)
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Re: Les etapes du sequençage

Messagepar jonathan.d » 18 Jan 2018, 11:07

Beaucoup plus clair, merci beaucoup :)
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Re: Les etapes du sequençage

Messagepar Grohl » 18 Jan 2018, 16:20

+1 j'avais pas trop compris cette partie mais c'est super claire et tu l'as vraiment bien expliqué merci!
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