Hey !
Justement c'est tout le concept du deuxième cours en fait
Part contre ça n'a pas de sens de parler de "méthode pour séquencer des exons à partir d'ADN" tu as peut-être compris mais ta question est mal formulée
On ne sait pas interpréter le séquençage des introns, ça ne sert donc à rien de les séquencer parce que de toute façon on ne comprendra pas ce qu'on lit, on ne verra donc pas un changement éventuel dans la séquence nucléotidique liée à une mutation
Par contre on sait interpréter le séquençage des exons et des jonctions introns / exons !
Or on sait que quand on a un variant d'épissage, une portion intronique va devenir exonique, elle va donc devenir "séquençable" ou plutôt interprétable !
Ça c'est pour le concept de base, maintenant tout part de l'ARNm: lorsqu'il est normalement épissé, il ne contient pas d'introns sauf dans le cas du variant d'épissage où une portion intronique va rester et se comporter comme un exon: notre ARNm contient donc toutes les portions exoniques plus un petit bout qui s'est rajouté par rapport à un ARNm sain: il s'agit de l'intron devenu codant à cause du site cryptique d'épissage qu'on cherche justement à identifier !
Du coup on va vouloir séquencer toute la portion initialement intronique qui s'est rajoutée :
- Soit on fait du whole genome sequencing avec un NGS et on séquence tout le gène (introns + exons) comme un bourrin
- Soit on s'arrange pour ne séquencer que les exons qu'on connaît et la portion intronique qui s'est rajoutée qu'on veut identifier
On choisit la deuxième option qui est plus simple, et la seule solution est alors de repartir de l'ARNm: il contient en version ARN tous les exons et une portion rajoutée initialement intronique qui est celle que je veux séquencer.
On transforme tout ça en exon et on obtient un ADNc différent de l'ADN de base du patient: cet ADNc n'a pas la séquence complète du gène WFS1 avec ses exons et ses introns, comme il est issu d'un ARNm mature qui possède un site cryptique d'épissage, il contient uniquement en plus des exons la portion qui n'a pas été épissée alors qu'elle aurait dut l'être ! Je te rappelle que le concept de l'épissage est de virer tous les introns de l'ARNm, sauf que lorsqu'il y a un variant d'épissage ce système est mis en défaut et une portion intronique située juste après le site cryptique d'épissage va demeurer dans l'ARNm pour être traduite et ce de façon pathologique ! C'est pour ça que ça a du sens de travailler à l'envers à partir de l'ARNm, on remonte à la source du problème: une portion anormalement traduite ! Si tu veux comme on connaît tout de l'ARNm lorsqu'il est normalement épissé, la seule chose qu'on ne reconnaîtra pas est forcément ce que l'on cherche, c'est comme ça qu'on va isoler et identifier le variant d'épissage ! On le transforme juste en ADNC car toutes les techniques qu'on veut utiliser par la suite (notamment la PCR et le séquençage) ne fonctionnent pas sur de l'ARN
En séquençant cet ADNc, on reconnaîtra toutes les séquences d'exons sauf une partie qui nous est inconnue: on en déduira que c'est le variant d'épissage avec au début de sa séquence le site cryptique d'épissage qui nous intéresse !
Le séquençage est par contre dans un premier temps illisible car le variant est mélangé avec l'autre allèle de l'individu qui est soit sain soit muté différemment avec une substitution de base, il y a donc un décalage de leurs séquences
respectives ce qui nous oblige à passer par du clonage moléculaire afin de séparer les allèles pour pouvoir les séquencer séparément !
C'est mieux ?
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